Molecular markers from LipL36 gene and IS 1533 for identifying Leptospires by technique Polymerase Chain Reaction

Abstract

Leptospire sp. is a spirocheate bacterias that causes leptospirosis in animals and human. The results from PCR identification method by two sets of primer (G1, G2, B64I and B64II) with Thailand pathogenic leptospires shown different results from the earlier reports and they can not be used as molecular markers for serovars identification Leptospires cultured from local strain pathogen. In this experiment, we constructed molecular markers by sets of primer from different genes, genes encoding outer membrane protein, LipL36 and OmpL1, and gene IS1533. Size and amount of PCR products were used as markers. They were generated by low stringency condition (LS-PCR) for LipL36 primer set, and by amplifying DNA fragments adjacent IS1533. The results from 24 reference Leptospire sp. serovars has shown that molecular markers from LipL36 primers has more polymorphic and strong PCR products than IS-1 primer. PCR products from both primer sets can be used as molecular markers for serovars identification. Although, the data from IS-1 primer can not solely differentiate each serovars. Therefore, we suggest to use these markers from both primer sets together for leptospire sp. identification.

เชื้อเลปโตสไปร์เป็นเชื้อแบคทีเรียชนิดสไปโรขีดที่เป็นสาเหตุของโรคเลปโตสไปโรซีส ซึ่งการตรวจวินิจฉัยด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสด้วยไพรเมอร์ G1/G2 และ B64I/B64II กับเชื้อเลปโตสไปร์ที่ก่อโรคในประเทศไทย ให้ผลที่แตกต่างจากการรายงานมาก่อนหน้านี้ อีกทั้งยังไม่สามารถจำแนกในระดับซีโรวาร์ได้ ดังนั้นในการทดลองนี้จึงได้ทำการสร้างเครื่องหมายโมเลกุลโดยใช้ไพรเมอร์ 2 ชุดซึ่งมีการออกแบบจากส่วนของสารพันธุกรรมที่ทำหน้าที่ต่างกัน คือไพรเมอร์ที่ออกแบบจากข้อมูลของยีน LipL36 และ OmpL1 ซึ่งเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างแอนติเจนบนผิวเซลล์ของเชื้อเลปโตสไปร์แล้วนำมาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสแบบ low-striengency PCR (LS-PCR) และใช้ไพรเมอร์ IS-1 ซึ่งออกแบบมาจากข้อมูลของ IS1533 ซึ่งเป็นส่วนของ insertion sequence โดยจะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่อยู่ระหว่าง IS1533 ที่อยู่ติดกัน จากผลการทดลองพบว่าเครื่องหมายโมเลกุลที่ได้จากการใช้ไพรเมอร์ LipL36 ด้วยวิธี LS-PCR กับเชื้อเลปโตสไปร์อ้างอิง 24 ซีโรวาร์ มีปริมาณและขนาดที่หลากหลายมากกว่าเมื่อนำมาเปรียบเทียบกับเครื่องหมายโมเลกุลที่ได้จากไพรเมอร์ IS-1 และข้อมูลเครื่องหมายโมเลกุลที่ได้จากไพรเมอร์ทั้งสอง สามารถนำมาใช้ในการจำแนกเชื้อเลปโตสไปร์แต่ละซีโรวาร์ได้ อย่างไรก็ตามข้อมูลที่ได้จากการใช้ไพรเมอร์ IS-1 เพียงชุดเดียวยังไม่สามารถใช้ในการจำแนกเชื้อในบางซีโรวาร์ได้ ดังนั้นในการนำเครื่องหมายโมเลกุลที่ได้ไปใช้ในการจำแนกเชื้อแต่ละซีโรวาร์ทางห้องปฏิบัติการจึงต้องมีการใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ได้จากไพรเมอร์ทั้งสองมาประกอบร่วมกัน